“一带一路”国际生猪产业大会会议笔记18 | 杜向党:猪源ST25型源肺炎克雷伯菌感染的出现及防控
作者：微信文章2025年8月14-16日，第二届“一带一路”国际生猪产业大会暨猪健康创新峰会将在中国郑州盛大举行。本次峰会由河南农业大学、欧洲猪健康管理学院（ECPHM）及行业领袖牧原食品股份有限公司联合主办，汇聚了全球顶尖的专家学者与行业领袖。
大会聚焦生猪健康领域的前沿科技与创新实践，与会专家们将围绕PRRS净化、非洲猪瘟防控、人工智能在猪场的应用及精准繁殖技术等关键议题，分享最新的研究成果与宝贵经验，共同推动产业的协同发展。
为将这份宝贵的行业智慧传递给更多同仁，冠牧精准诊断团队特将大会的精华内容梳理提炼。我们将通过“冠牧精准诊断”公众号，陆续与您分享本次大会的学习笔记，希望能与您共同学习，携手进步。敬请持续关注！
会议笔记（一）
报告人：曲东帅，丹俄国际
报告主题：猪群圆环和肺炎支原体控制案例报告
会议笔记（二）
报告人：Heiko Nathues教授，苏黎世兽医学院
报告主题：欧洲PRRS净化的经验教训和关键技术
会议笔记（三）
报告人：于林洋，河南农业大学
报告主题：我国猪源盖塔病毒的首次发现与流行现状
会议笔记（四）
报告人：宋春城，环山集团
报告主题：轮状病毒反饲在仔猪腹泻防控中的应用
会议笔记（五）
报告人：孔苗苗，河南新航道
报告主题：非洲猪瘟弱毒株精准剔除的关键点
会议笔记（六）
报告人：素朴·瓦塔纳庞萨克，朱拉隆功大学
报告主题：泰国非洲猪瘟防控的得与失
会议笔记（七）
报告人：胡冬，牧原股份
报告主题：牧原数智化养殖实践与探索
会议笔记（八）
报告人：贺俊畅，银发牧业
报告主题：通过精准清除控制蓝耳阴性场感染
会议笔记（九）
报告人：魏战勇，河南农业大学
报告主题：做猪场需要的科研-规模化猪场病原流行及传播规律研究
会议笔记（十）
报告人：李永涛，河南农业大学
报告主题：中亚地区畜禽养殖业概况与动物疫病防控现状
会议笔记（十一）
报告人：佘志成，金宇生物
报告主题：基于返饲的PED整体防控方案实践及探讨
会议笔记（十二）
报告人：Myroslav，丹俄国际
报告主题：欧洲经验在中国GGP猪场的管理实践
会议笔记（十三）
报告人：李文涛，华中农业大学
报告主题：猪流行性腹泻（PED）流行新动态与精准弱毒疫苗研发策略深度解读
会议笔记（十四）
报告人：Heiko Nathues教授，苏黎世兽医学院
报告主题：不同猪支原体肺炎净化方法的成功率与关键点
会议笔记（十五）
报告人：赵康宁，博士
报告主题：大体系蓝耳净化的实践与思考
会议笔记（十六）
报告人：Alexander Grahofer，伯尔尼大学
报告主题：如何解决夏季高温高湿下的猪群热应激反应问题
会议笔记（十七）
报告人：Alexander Grahofer，伯尔尼大学
报告主题：猪出血性肠炎综合征
会议笔记（十八）
报告人：杜向党，河南农业大学
报告主题：猪源ST25型肺炎克雷伯菌感染的出现及防控
近日，在一次行业技术分享会上，来自河南农业大学的杜向党教授就“猪源ST25型肺炎克雷伯菌感染的出现及防控”这一主题，分享了其团队的最新研究成果。杜教授指出，肺炎克雷伯菌已从过去一个被认为是肠道正常菌群的机会性病原，在强大的抗生素选择压力下，进化为当前临床医学和养殖业中一个极其重要的病原菌。其同时具备的抗生素耐药性（AMR）、高毒力（virulence）以及侵袭性（invasive）三大特征，使其引发的感染极难治疗，已成为全球公共卫生领域面临的严峻挑战。
杜向党，河南农业大学教授，博士生导师，入选中组部第三批国家“万人计划”领军人才，第十届河南省优秀专家。兼任中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会副理事长，中国兽医协会兽医科学用药分会副会长，第六、七届中国兽药典委员会委员，第一届全国兽药评审咨询专家库成员，主要从事病原菌耐药与噬菌体防控研究，先后主持国家自然基金6项（含区域创新重点1项），十四五重点研发计划课题，科技部高端外国专家引进计划等。在 Lancet Infect Dis 、Sci Adv 、 Clin Microbiol Infect 、 Clin Microbiol Rev、Adv Healthc Mater等期刊发表SCI论文70篇，获河南省科技进步二等奖1项 。
本次分享系统性地阐述了该病原的耐药机制、猪场新发高毒力菌株的致病性、快速检测技术的开发以及新型噬菌体防控方案。
一、肺炎克雷伯菌的流行现状与替加环素耐药机制
讲者首先展示了碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌（CR-HvKP）在人医临床上的严峻流行现状。数据显示，多种K血清型（如KL64, KL47等）和耐药基因在中国各地呈现复杂的流行和演变趋势。一个危险的信号是，编码毒力因子（如与荚膜合成、铁载体相关的基因）的遗传物质，正越来越多地从细菌染色体转移至质粒上。这种变化意味着，临床上抗生素的使用不仅会筛选耐药性，还会通过质粒的水平传播，协同扩散毒力基因，从而催生出“高毒力、高耐药”的超级细菌。
由于其普遍的耐药性，肺炎克雷伯菌感染已成为一个重要的医学挑战。世界卫生组织（WHO）在2024年发布的最新“优先病原体预警清单”中，已将耐碳青霉烯的肠杆菌目细菌列为需重点关注的“关键优先级”病原菌，美国CDC亦将其列为“紧急威胁”，这都凸显了对其进行研究和防控的全球共识和高度紧迫性。
在兽医领域虽不常用，但在人医领域，替加环素是治疗碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌感染的最后几道防线之一。杜教授团队的研究重点之一便是其耐药机制。研究首先发现了一个名为tet(A)v的耐药基因，它的出现会导致肺炎克雷伯菌对替加环素产生低水平的耐药表型。
然而，更值得警惕的是，细菌的进化速度远超想象。实验证明，携带tet(A)v基因的菌株在亚致死剂量的替加环素暴露下，可以在短短一天之内，迅速发展出对高达32 µg/mL浓度替加环素的高水平耐药。这意味着在临床或养殖环境中，不规范的用药可能在极短时间内催生出完全耐药的菌株。
其背后的分子机制是什么？研究发现，这种高水平耐药性的形成，并非源于携带耐药基因的质粒整体拷贝数的增加，而是tet(A)v基因本身在其所在的质粒上发生了拷贝数的扩增，进而导致其转录表达水平显著增强。
通过对耐药质粒进行深度测序分析，清晰地观察到，在药物诱导后，含有tet(A)v基因的约6Kb质粒序列区域，其测序深度（Read mapping）相较于质粒其他区域出现了数倍的显著增加，这直观地证明了该区域发生了局部扩增。
进一步的结构分析揭示了这一现象的结构基础。原来，在tet(A)v基因的两侧，存在着一段同源序列ΔtnpA。这段同源序列就像一个“书签”，使得包含tet(A)v在内的转座单元（Transposable Unit, TU）能够通过同源重组的方式，从质粒上精准地“切除”并“复制-粘贴”，从而在同一质粒上形成多拷贝的串联扩增结构。拷贝数越多，耐药基因表达量越高，从而导致了从低水平到高水平的耐药表型跃迁。
杜教授强调，这项发现意义重大，因为这种依赖同源序列扩增耐药基因的结构，在临床分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CRKP）中普遍存在，检出率高达65%（985/1607）。这也从分子层面解释了为何在养殖端必须严禁在饲料中添加促生长抗生素，因为即便是微量的药物残留，也足以对携带此类结构的细菌构成选择压力，从而极易筛选出难以控制的高水平耐药超级细菌。
二、猪源ST25型高毒力肺炎克雷伯菌的出现及毒力因子贡献
一次偶然的机会，杜教授团队的一位合作者在对某猪场发生严重肺炎并导致仔猪死亡的病例进行宏基因组学分析时，发现了一个优势病原——肺炎克雷伯菌。团队获取该菌株后，进行了深入研究。小鼠感染实验首先证实了其极强的毒力，通过腹腔注射或滴鼻途径均能导致小鼠快速死亡，其半数致死量（LD50）低至惊人的23 CFU（菌落形成单位）。
为了验证其对天然宿主猪的致病性，团队开展了更为严格的猪体攻毒试验。结果显示，该菌株能迅速导致健康的猪只发病死亡。病理剖检可见典型的全身性感染和浆膜炎症状：胸腔和腹腔内有大量黄色浑浊的积液和纤维素性渗出物，同时，肺脏、全身淋巴结普遍充血、出血，肾脏表面可见特征性的白色坏死斑点。
组织病理学（HE染色）切片结果进一步证实了该菌株对多器官的严重破坏力。肺脏组织切片可见大量以成纤维细胞和嗜中性粒细胞为主的炎性细胞浸润；肾脏、肝脏、脾脏和淋巴结也均观察到明显的出血和组织损伤。这一系列环环相扣的证据，确凿地证明了该猪源ST25型肺炎克雷伯菌是能够独立引起猪严重全身性感染和死亡的关键病原。
通过对NCBI数据库中2005-2024年间全球共328株ST25型肺炎克雷伯菌进行的系统进化分析，团队发现该型菌株在全球范围内广泛分布，主要分离自人类临床样本（87.5%），并在中国、日本、英国、美国等多个国家均有报道。
尤其值得关注的是，本次从猪体内分离的菌株，与来自中国、越南等地的人类临床病例分离株在进化树上处于同一分支，亲缘关系非常接近。杜教授特别指出，这一发现揭示了ST25型肺炎克雷伯菌具备巨大的人兽共患传播风险。他以猪链球菌为例，该病原在南方地区常因屠宰或处理病猪过程中的伤口接触，导致人感染，严重者可致死或造成永久性听力损伤。ST25型肺炎克雷伯菌的跨物种传播潜力，同样需要养殖业和公共卫生领域的高度警惕。
对这株猪源ST25高毒力菌株的基因组学分析显示，其大部分毒力因子（如编码荚膜、菌毛等的基因）仍稳定地位于染色体上。然而，一个关键的、编码铁载体合成的毒力基因簇iucABCD-iutA，被发现位于一个大小为252kb的可接合性质粒上。这是一个危险的信号，因为质粒的转移性为毒力基因在不同细菌间的快速水平传播提供了便车，是病原菌进化的重要驱动力。
为了精准评估各个毒力因子在致病过程中的“贡献度”，团队利用成熟的基因编辑技术，构建了多个关键毒力基因的缺失突变株，主要靶向了与荚膜和铁吸收相关的基因，包括：荚膜多糖合成基因wcaj、荚膜合成的正调控因子rmpA、以及两种铁载体系统基因iroB和iucABCD-iutA。
对各突变株的表型进行验证，通过测定荚膜多糖（糖醛酸）的产量发现，直接敲除合成基因wcaj或调控基因rmpA，都会导致荚膜的产生能力显著下降甚至丧失。而负责铁吸收的iroB或iuc基因簇的缺失，则不影响荚膜的合成。
最终，通过动物感染模型对各缺失株的毒力变化进行了定量评估，得出了清晰的结论：
· 荚膜合成基因（wcaj）缺失：导致菌株毒力被完全剥夺，小鼠在超高剂量攻击下仍能100%存活。
· 荚膜调控因子（rmpA）缺失：菌株毒力急剧下降了4个数量级（10,000倍）。
· 铁载体（iroB及iucABCD-iutA）缺失：菌株毒力均下降了2个数量级（100倍）。
这一系列严谨的实验强有力地证明：荚膜是该猪源高毒力肺炎克雷伯菌致病性的核心武器，其合成与调控起着决定性作用。其次，其通过铁载体系统从宿主体内夺取铁离子的能力，也是其维持毒力的重要一环。
三、高毒力肺炎克雷伯菌的CRISPR/Cas12a快速现场检测
针对猪场对疫病“早发现、早处置”的迫切需求，团队开发了一种无需依赖大型PCR仪的快速现场检测技术。该技术巧妙地整合了RPA（重组酶聚合酶扩增）的恒温扩增特性和CRISPR/Cas12a系统的高特异性识别与切割能力。其原理是，先在39℃下通过RPA技术快速扩增样本中的靶基因，然后利用Cas12a系统识别扩增产物，一旦识别成功，Cas12a蛋白会被激活，并“疯狂”切割体系中加入的荧光报告分子，从而产生肉眼或手机摄像头可见的荧光信号。
该方法展现出卓越的性能：
· 高灵敏度：可实现对浓度低至102 cfu/mL菌液中多个毒力基因（iucA, iroB, peg-344, rmpA）和耐药基因（tet(A)）的同时、可视化检测。单次反应的检测限可达1 cfu。
· 快速：包括样本前处理在内，整个检测过程可在60分钟内完成。
· 便捷：全程恒温操作，无需精密温控仪器，结果可通过便携荧光仪甚至智能手机拍照进行判读。
严格的特异性测试表明，该检测体系只对目标菌株的特定基因产生阳性信号，与传统的肺炎克雷伯菌、其他耐药菌株或常见的肠道菌（如大肠杆菌、沙门氏菌）均无交叉反应，确保了检测结果的准确可靠。
尤为关键的是，团队通过动物实验验证了该方法的临床适用性。他们对感染了高毒力肺炎克雷伯菌的小鼠进行尾静脉采血，在不经过复杂的DNA纯化步骤，仅对血液样本进行快速裂解处理后，直接上机检测。结果显示，该方法成功地从复杂的血液背景中精准地检出了病原体，且检测结果与耗时数天的传统病原分离鉴定结果完全一致。这充分证明了该技术具备直接应用于临床样本和复杂环境样本的强大能力，为猪病的现场即时诊断（POCT）提供了有力的技术储备。
四、肺炎克雷伯菌感染的噬菌体控制策略
面对日益严峻的“后抗生素时代”挑战，开发非抗生素类抗菌策略已是当务之急。杜教授团队在噬菌体（Bacteriophage）这一领域进行了系统性布局。他们首先投入大量精力，建立了覆盖广泛的肺炎克雷伯菌病原库，收集并测序了超过2000株菌，共鉴定出93种ST型和70种不同的血清型。
在此基础上，团队针对性地分离、鉴定并建立了一个庞大的肺炎克雷伯菌噬菌体库。目前，该噬菌体库已能有效裂解实验室保藏的70种血清型中的45种，覆盖率超过64%。杜教授展望，未来可以利用人工智能和大数据匹配技术，一旦通过快速诊断明确了猪场流行的病原血清型，就能从库中快速筛选出最高效的噬菌体或“鸡尾酒”组合，实现精准、定制化的噬菌体治疗。
讲座中，杜教授以一株名为vB_KpnP_B1的噬菌体为例，详细展示了其作为“噬菌体药物”候选者的全面评估过程，包括其清晰的裂解斑形态、典型的肌尾噬菌体科的电镜结构、以及一系列关键的生物学特性，如最佳感染复数（MOI）、一步生长曲线、对宿主菌的吸附能力以及对外界环境（温度、酸碱度）的耐受性等。
在评价其体内疗效时，团队首先使用了大蜡螟作为昆虫感染模型。结果显示，对于致死剂量感染的大蜡螟，未经治疗的对照组几乎全部死亡，而使用该噬菌体进行治疗后，72小时存活率可从5%戏剧性地提升至87.5%，初步验证了其强大的体内抗菌活性。
随后，在更为关键的小鼠感染模型中，噬菌体的治疗效果得到了进一步证实。对于同样致死剂量感染的小鼠，通过腹腔注射噬菌体进行治疗，7天内的存活率最高可达100%，展现了近乎完美的保护效果。
为了探究其作用机制，团队动态监测了治疗后小鼠体内病原和噬菌体的载量变化。结果清晰显示，在噬菌体治疗组，小鼠血液及肝、脾、肺、肾等重要器官中的细菌载量在感染初期短暂上升后，便被迅速、显著地清除。
与细菌被清除相对应的是，组织病理学分析显示，受损的肝脏和肾脏组织在噬菌体治疗24小时后，其病理损伤便开始逐渐减轻；到72小时后，治疗组小鼠的组织形态已恢复正常，与健康对照组几乎没有差异。这表明噬菌体疗法不仅能有效杀灭病原，更能高效地控制炎症反应，促进机体组织的修复。
结论与展望
最后，杜向党教授对本次分享进行了系统性总结。其团队的研究工作环环相扣，取得了丰硕成果：
1. 机制层面：首次揭示了肺炎克雷伯菌中tet(A)v基因可通过侧翼同源序列介导的串联扩增，实现从低水平到高水平替加环素耐药的快速进化，为理解细菌耐药性演化提供了新的范例。
2. 流行病学层面：首次在国内报道了猪群中存在高致病性的ST25型肺炎克雷伯菌，通过严谨的动物实验阐明了其强大的致病性，并通过遗传进化分析警示了其严峻的人兽共患风险。
3. 诊断技术层面：成功开发了一套可用于现场的CRISPR/Cas12a快速检测方法，实现了对高毒力及耐药肺炎克雷伯菌的快速、精准、便携式检测。
4. 治疗策略层面：前瞻性地构建了覆盖45种血清型的CRKP噬菌体库，并系统验证了候选噬菌体在动物模型中的高效治疗作用，为应对耐药菌感染提供了极具潜力的“活的药物”。
这些成果为未来精准防控日益严峻的猪肺炎克雷伯菌病，提供了坚实的理论依据、创新的技术工具和充满希望的治疗方案。
冠牧学习心得
· 高度警惕人兽共患风险：猪场出现的ST25型高毒力肺炎克雷伯菌与人类临床菌株亲缘关系近，存在双向传播风险。猪场兽医需加强生物安全措施，特别是在处理有呼吸道症状的病猪时，做好个人防护，防止潜在的职业暴露。
· 重新认识“低水平耐药”的威胁：tet(A)v基因的存在看似只引起低水平耐药，但在药物选择压力下可迅速进化为高水平耐药。这启示我们，任何不规范的抗生素使用都可能成为“压垮骆驼的最后一根稻草”，必须严格执行兽药使用规范，避免亚剂量或长期预防性用药。
· 诊断关口前移，拥抱新工具：基于CRISPR/Cas12a的现场快速检测技术，为猪场提供了在60分钟内精准识别高毒力、耐药肺炎克雷伯菌的能力。一线兽医应关注并尝试应用这类新式诊断工具，实现早期发现、早期隔离，将疫病控制在萌芽状态。
· 关注噬菌体疗法的应用前景：面对棘手的多重耐药菌感染，噬菌体展现了巨大的潜力。讲座中展示的噬菌体库和动物模型治疗效果，预示着未来猪场或可拥有“定制化”的噬菌体制剂作为抗生素的有效替代或补充方案，值得行业持续关注和探索。
知识的终点，是行动的开始
作为一场融合全球顶尖智慧的行业盛会，第二届“一带一路”国际生猪产业大会暨猪健康创新峰会为产业的创新发展注入了强劲动力。我们向大会主办方河南农业大学、欧洲猪健康管理学院（ECPHM）、牧原食品、一带一路国际生猪产业大会等单位致以诚挚的感谢 。感谢他们强强联合，为行业同仁搭建了如此高规格、国际化的交流平台，让前沿科技与创新实践得以交融碰撞。
大会为猪只健康管理指明了创新的方向，而我们的使命，就是将这些宝贵的行业智慧，转化为猪场内触手可及的精准诊断工具与解决方案。为了能持续获取未来行业盛会的前沿资讯，我们强烈推荐您关注“国际生猪产业大会”公众号。
同时，也请持续锁定“冠牧精准诊断”，让我们作为您身边的“兽医检测专家”，共同推动这些先进理念在一线落地生根，为中国养殖业的健康、可持续发展贡献力量！
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